Механизм ингибирования алармонсинтетаз микобактерий синтетическим аналогом эрогоргиаена

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Синтез алармонов (p)ppGpp (гуанозинтетрафосфата и гуанозинпентафосфата) вносит значительный вклад в процессы торможения метаболизма бактерий, контроля над скоростью их роста, вирулентности, бактериальной персистенции и формирования биоплёнок. Продукцию регуляторных молекул (p)ppGpp осуществляют бактериальные ферменты (p)ppGpp-синтетазы суперсемейства гомологов RelA/SpoT двух типов: длинные бифункциональные RSH-белки и малые алармонсинтетазы. В данной работе при помощи методов ферментативной кинетики и концентрационно-зависимого ингибирования исследуются детали механизма действия 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановой кислоты (ДМНП) в отношении белков RelMsm и RelZ, (p)ppGpp-синтетаз Mycolicibacterium smegmatis обоих типов, и белка RelMtb Mycobacterium tuberculosis. Обнаружена способность соединения ДМНП подавлять активность белка RelMtb. В соответствии с результатами исследований ферментативной кинетики ДМНП проявляет себя как неконкурентный ингибитор, действующий на белки RelMsm и RelZ. Анализ молекулярного докинга позволил определить вероятное место связывания ДМНП – вблизи активного сайта синтетазного домена (p)ppGpp-синтетаз. Исследование вносит вклад в разработку нового класса соединений ингибиторов алармонсинтетаз, к которым относится релацин и его производные, а также изучаемое соединение ДМНП – синтетический аналог метаболита морских кораллов эрогоргиаена. В отличие от традиционных антибиотиков, ингибиторы алармонсинтетаз оказывают влияние на метаболические пути, связанные со строгим ответом. Хотя эти пути не являются ключевыми для бактерий, они регулируют формирование адаптационных механизмов. Сочетание традиционных антибиотиков, действующих на растущие клетки, и новых соединений, блокирующих адаптацию микроорганизмов, потенциально способно решить актуальные проблемы резистентности к антибиотикам и бактериальной персистенции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Р. Ю. Сидоров

Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук; Пермский государственный национальный исследовательский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: sidorov.r@iegm.ru
Россия, Пермь; Пермь

А. Г. Ткаченко

Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук; Пермский государственный национальный исследовательский университет

Email: sidorov.r@iegm.ru
Россия, Пермь; Пермь

Список литературы

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., and Balaban, N. Q. (2016) Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment, Nat. Rev. Microbiol., 14, 320-330, https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.34.
  2. Shao, Y., Song, H., Li, G., Li, Y., Li, Y., Zhu, L., Lu, W., and Chen, C. (2021) Relapse or re-infection, the situation of recurrent tuberculosis in Eastern China, Front. Cell. Infect., 11, 638990, https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.638990.
  3. Rosser, A., Marx, F. M., and Pareek, M. (2018) Recurrent tuberculosis in the pre-elimination era, Int. J. Tuberc. Lung Dis., 22, 139-150, https://doi.org/10.5588/ijtld.17.0590.
  4. Mandal, S., Njikan, S., Kumar, A., Early, J. V., and Parish, T. (2019) The relevance of persisters in tuberculosis drug discovery, Microbiology (Reading), 165, 492-499, https://doi.org/10.1099/mic.0.000760.
  5. Grace, A. G., Mittal, A., Jain, S., Tripathy, J. P., Satyanarayana, S., Tharyan, P., and Kirubakaran, R. (2019) Shortened treatment regimens versus the standard regimen for drug-sensitive pulmonary tuberculosis, Cochrane Database Syst. Rev., 12, CD012918, https://doi.org/10.1002/14651858.CD012918.pub2.
  6. Niño-Padilla, E. I., Velazquez, C., and Garibay-Escobar, A. (2021) Mycobacterial biofilms as players in human infections: a review, Biofouling, 37, 410-432, https://doi.org/10.1080/08927014.2021.1925886.
  7. Nguyen, D., Joshi-Datar, A., Lepine, F., Bauerle, E., Olakanmi, O., Beer, K., McKay, G., Siehnel, R., Schafhauser, J., Wang, Y., Britigan, B. E., and Singh, P. K. (2011) Active starvation responses mediate antibiotic tolerance in biofilms and nutrient-limited bacteria, Science, 334, 982-986, https://doi.org/10.1126/science.1211037.
  8. Gupta, K. R., Arora, G., Mattoo, A., and Sajid, A. (2021) Stringent response in Mycobacteria: from biology to therapeutic potential, Pathogens (Basel, Switzerland), 10, 1417, https://doi.org/10.3390/pathogens10111417.
  9. Hobbs, J. K., and Boraston, A. B. (2019) (p)ppGpp and the stringent response: an emerging threat to antibiotic therapy, ACS Infect. Dis., 5, 1505-1517, https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.9b00204.
  10. Dutta, N. K., Klinkenberg, L. G., Vazquez, M. J., Segura-Carro, D., Colmenarejo, G., Ramon, F., Rodriguez-Miquel, B., Mata-Cantero, L., Porras-De Francisco, E., Chuang, Y.-M., Rubin, H., Lee, J. J., Eoh, H., Bader, J. S., Perez-Herran, E., Mendoza-Losana, A., and Karakousis, P. C. (2019) Inhibiting the stringent response blocks Mycobacterium tuberculosis entry into quiescence and reduces persistence, Sci. Adv., 5, eaav2104, https://doi.org/10.1126/sciadv.aav2104.
  11. Weiss, L. A., and Stallings, C. L. (2013) Essential roles for Mycobacterium tuberculosis Rel beyond the production of (p)ppGpp, J. Bacteriol., 195, 5629-5638, https://doi.org/10.1128/JB.00759-13.
  12. Atkinson, G. C., Tenson, T., and Hauryliuk, V. (2011) The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life, PLoS One, 6, e23479, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023479.
  13. Wexselblatt, E., Oppenheimer-Shaanan, Y., Kaspy, I., London, N., Schueler-Furman, O., Yavin, E., Glaser, G., Katzhendler, J., and Ben-Yehuda, S. (2012) Relacin, a novel antibacterial agent targeting the stringent response, PLoS Pathog., 8, e1002925, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002925.
  14. Wexselblatt, E., Kaspy, I., Glaser, G., Katzhendler, J., and Yavin, E. (2013) Design, synthesis and structure-activity relationship of novel Relacin analogs as inhibitors of Rel proteins, Eur. J. Med. Chem., 70, 497-504, https:// doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.10.036.
  15. Syal, K., Flentie, K., Bhardwaj, N., Maiti, K., Jayaraman, N., Stallings, C. L., and Chatterji, D. (2017) Synthetic (p)ppGpp analogue is an inhibitor of stringent response in mycobacteria, Antimicrob. Agents Chemother., 61, e00443-17, https://doi.org/10.1128/AAC.00443-17.
  16. Beljantseva, J., Kudrin, P., Jimmy, S., Ehn, M., Pohl, R., Varik, V., Tozawa, Y., Shingler, V., Tenson, T., Rejman, D., and Hauryliuk, V. (2017) Molecular mutagenesis of ppGpp: turning a RelA activator into an inhibitor, Sci. Rep., 7, 41839, https://doi.org/10.1038/srep41839.
  17. Syal, K., Bhardwaj, N., and Chatterji, D. (2017) Vitamin C targets (p)ppGpp synthesis leading to stalling of long-term survival and biofilm formation in Mycobacterium smegmatis, FEMS Microbiol. Lett., 364, fnw282, https:// doi.org/10.1093/femsle/fnw282.
  18. Tkachenko, A. G., Kashevarova, N. M., Sidorov, R. Y., Nesterova, L. Y., Akhova, A. V., Tsyganov, I. V., Vaganov, V. Yu., Shipilovskikh, S. A., Rubtsov, A. E., and Malkov, A. V. (2021) A synthetic diterpene analogue inhibits mycobacterial persistence and biofilm formation by targeting (p)ppGpp synthetases, Cell Chem. Biol., 28, 1420-1432.e9, https:// doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.01.018.
  19. Sidorov, R. Yu., and Tkachenko, A. G. (2023) DMNP, a synthetic analog of erogorgiaene, inhibits the ppGpp synthetase activity of the small alarmone synthetase RelZ, BIO Web Conf., 57, 08002, https://doi.org/10.1051/ bioconf/20235708002.
  20. Danchik, C., Wang, S., and Karakousis, P. C. (2021) Targeting the Mycobacterium tuberculosis stringent response as a strategy for shortening tuberculosis treatment, Front. Microbiol., 12, 744167, https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.744167.
  21. Jain, V., Saleem-Batcha, R., China, A., and Chatterji, D. (2006) Molecular dissection of the mycobacterial stringent response protein Rel, Protein Sci., 15, 1449-1464, https://doi.org/10.1110/ps.062117006.
  22. Murdeshwar, M. S., and Chatterji, D. (2012) MS_RHII-RSD, a dual-function RNase HII-(p)ppGpp synthetase from Mycobacterium smegmatis, J. Bacteriol., 194, 4003-4014, https://doi.org/10.1128/JB.00258-12.
  23. Singal, B., Balakrishna, A. M., Nartey, W., Manimekalai, M. S. S., Jeyakanthan, J., and Grüber, G. (2017) Crystallographic and solution structure of the N-terminal domain of the Rel protein from Mycobacterium tuberculosis, FEBS Lett., 591, 2323-2337, https://doi.org/10.1002/1873-3468.12739.
  24. Akhova, A. V., and Tkachenko, A. G. (2019) HPLC-UV method for simultaneous determination of adenosine triphosphate and its metabolites in Mycobacterium smegmatis, Acta Chromatogr., 31, 45-48, https:// doi.org/10.1556/1326.2017.00344.
  25. Petchiappan, A., Naik, S. Y., and Chatterji, D. (2020) RelZ-mediated stress response in Mycobacterium smegmatis: pGpp synthesis and its regulation, J. Bacteriol., 202, e00444-19, https://doi.org/10.1128/JB.00444-19.
  26. Bag, S., Das, B., Dasgupta, S., and Bhadra, R. K. (2014) Mutational analysis of the (p)ppGpp synthetase activity of the Rel enzyme of Mycobacterium tuberculosis, Arch. Microbiol., 196, 575-588, https://doi.org/10.1007/s00203-014-0996-9.
  27. Pedersen, F. S., and Kjeldgaard, N. O. (1977) Analysis of the relA gene product of Escherichia coli, Eur. J. Biochem., 76, 91-97, https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1977.tb11573.x.
  28. Wong, F., Krishnan, A., Zheng, E. J., Stärk, H., Manson, A. L., Earl, A. M., Jaakkola, T., and Collins, J. J. (2022) Benchmarking AlphaFold-enabled molecular docking predictions for antibiotic discovery, Mol. Syst. Biol., 18, e11081, https://doi.org/10.15252/msb.202211081.
  29. Varadi, M., Anyango, S., Deshpande, M., Nair, S., Natassia, C., Yordanova, G., Yuan, D., Stroe, O., Wood, G., Laydon, A., Žídek, A., Green, T., Tunyasuvunakool, K., Petersen, S., Jumper, J., Clancy, E., Green, R., Vora, A., Lutfi, M., Figurnov, M., Cowie, A., Hobbs, N., Kohli, P., Kleywegt, G., Birney, E., Hassabis, D., and Velankar, S. (2022) AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models, Nucleic Acids Res., 50, D439-D444, https://doi.org/10.1093/nar/gkab1061.
  30. Steinchen, W., and Bange, G. (2016) The magic dance of the alarmones (p)ppGpp, Mol. Microbiol., 101, 531-544, https://doi.org/10.1111/mmi.13412.
  31. Sánchez-Linares, I., Pérez-Sánchez, H., Cecilia, J. M., and García, J. M. (2012) High-throughput parallel blind virtual screening using BINDSURF, BMC Bioinformatics, 13, S13, https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-S14-S13.
  32. Nanamiya, H., Kasai, K., Nozawa, A., Yun, C. S., Narisawa, T., Murakami, K., Natori, Y., Kawamura, F., and Tozawa, Y. (2008) Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis, Mol. Microbiol., 67, 291-304, https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.06018.x.
  33. Salzer, A., Keinhörster, D., Kästle, C., Kästle, B., and Wolz, C. (2020) Small alarmone synthetases RelP and RelQ of Staphylococcus aureus are involved in biofilm formation and maintenance under cell wall stress conditions, Front. Microbiol., 11, 575882, https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.575882.
  34. Dasgupta, S., Basu, P., Pal, R. R., Bag, S., and Bhadra, R. K. (2014) Genetic and mutational characterization of the small alarmone synthetase gene relV of Vibrio cholerae, Microbiology (Reading), 160, 1855-1866, https://doi.org/ 10.1099/mic.0.079319-0.
  35. Gaca, A. O., Kudrin, P., Colomer-Winter, C., Beljantseva, J., Liu, K., Anderson, B., Wang, J. D., Rejman, D., Potrykus, K., Cashel, M., Hauryliuk, V., and Lemos, J. A. (2015) From (p)ppGpp to (pp)pGpp: characterization of regulatory effects of pGpp synthesized by the small alarmone synthetase of Enterococcus faecalis, J. Bacteriol., 197, 2908-2919, https://doi.org/10.1128/JB.00324-15.
  36. Syal, K., Joshi, H., Chatterji, D., and Jain, V. (2015) Novel pppGpp binding site at the C-terminal region of the Rel enzyme from Mycobacterium smegmatis, FEBS J., 282, 3773-3785, https://doi.org/10.1111/febs.13373.
  37. Roghanian, M., Van Nerom, K., Takada, H., Caballero-Montes, J., Tamman, H., Kudrin, P., Talavera, A., Dzhygyr, I., Ekström, S., Atkinson, G. C., Garcia-Pino, A., and Hauryliuk, V. (2021) (p)ppGpp controls stringent factors by exploiting antagonistic allosteric coupling between catalytic domains, Mol. Cell, 81, 3310-3322.e6, https://doi.org/ 10.1016/j.molcel.2021.07.026.
  38. Krishnan, S., Petchiappan, A., Singh, A., Bhatt, A., and Chatterji, D. (2016) R-loop induced stress response by second (p)ppGpp synthetase in Mycobacterium smegmatis: functional and domain interdependence, Mol. Microbiol., 102, 168-182, https://doi.org/10.1111/mmi.13453.
  39. Yang, N., Xie, S., Tang, N. Y., Choi, M. Y., Wang, Y., and Watt, R. M. (2019) The Ps and Qs of alarmone synthesis in Staphylococcus aureus, PLoS One, 14, e0213630, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213630.
  40. Steinchen, W., Schuhmacher, J. S., Altegoer, F., Fage, C. D., Srinivasan, V., Linne, U., Marahiel, M. A., and Bange, G. (2015) Catalytic mechanism and allosteric regulation of an oligomeric (p)ppGpp synthetase by an alarmone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 13348-13353, https://doi.org/10.1073/pnas.1505271112.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Доменный состав ферментов суперсемейства RSH, катализирующих синтез и гидролиз алармонов (p)ppGpp. Бифункциональные длинные RSH, такие как RelMsm из M. smegmatis и RelMtb из M. tuberculosis, включают гидролазный (HYD) и синтетазный (SYN) домены в каталитической доле, а также С-терминальный регуляторный домен (REG). Монофункциональные короткие RSH содержат либо гидролазный, либо синтетазный домен. RelZ из M. smegmatis является необычной малой алармонсинтетазой, так как содержит также домен РНКазы HII (HII)

Скачать (107KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние ингибитора ДМНП на ферментативную кинетику (p)ppGpp-синтетаз M. smegmatis. a – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelNTD спустя: 1 – 0 ч или 2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 1 мМ GTP, 4 мМ ATP). б – Анализ ферментативной кинетики N-терминального домена белка RelMsm из M. smegmatis. Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1 мкмоль белка) от концентрации субстрата GTP: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП. в – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез очищенного фермента RelNTD. г – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelZ спустя: 1 – 0 ч или 2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 1 мМ GDP, 4 мМ ATP). д – Анализ ферментативной кинетики малой алармонсинтетазы RelZ из M. smegmatis. Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1 мкмоль белка) от концентрации субстрата GDP: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП. е – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез очищенного фермента RelZ. ж – График Хилла для реакции с RelZ: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП

Скачать (384KB)
Метаданные
4. Рис. 3. pppGpp-Синтезирующая активность длинного RSH-белка RelMtb из M. tuberculosis в диапазоне концентраций ДМНП (0–600 мкМ) в 5%-ном метаноле. Скорость реакции оценивается по изменению концентрации субстрата GTP. MetOH- – реакция без добавки метанола и ДМНП

Скачать (94KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Пространственное выравнивание и результаты молекулярного докинга трёхмерных структур белков-мишеней M. tuberculosis RelMtb (синий), M. smegmatis RelMsm (фиолетовый) и RelZ (жёлтый), предсказанных AlphaFold. SYN – синтетазный домен; HYD – гидролазный домен; CTD – регуляторный C-терминальный домен; TGS – домен TGS; HII – домен РНКазы HII. Кластеры связывания ДМНП (зелёный): 1 – соответствующий активному сайту синтетазного домена, 2 – располагающийся вблизи активного сайта синтетазного домена

Скачать (756KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024