Дизайн и подбор гидов для CRISPR/Cas9-опосредованного нокаута гена Kcnv2 в мышиных клетках

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Мутации в гене KCNV2 человека вызывают редкое наследственное заболевание сетчатки — дистрофию колбочек с повышенной активностью палочек (CDSRR), которая характеризуется прогрессирующей потерей зрения и нарушением цветоразличения. Ген KCNV2 кодирует субъединицу калиевого канала Kv8.2, играющую важную роль в нормальной работе фоторецепторов сетчатки. Поскольку в настоящее время этиотропной терапии для CDSRR не существует, генотерапия представляется перспективным методом лечения. Для проверки эффективности генотерапевтических подходов необходимо создание адекватной экспериментальной модели — нокаутной мышиной линии по гену Kcnv2. В нашем исследовании мы сосредоточились на подборе оптимальных гидовых РНК для нокаута данного гена с использованием системы CRISPR/Cas9 и их проверке на мышиной клеточной линии. Результаты экспериментов показали успешное создание одной маленькой 40 нуклеотидов (нт)) и нескольких больших делеций (1100–1400 нт) в гене Kcnv2. Эти данные подтверждают эффективность выбранных гидов и создают основу для разработки нокаутной мышиной модели, которая позволит изучать патофизиологию заболевания и провести тестирование потенциальных терапевтических методов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. Н. Антонова

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: antonova.en@genlab.llc
Россия, Долгопрудный, Московская область, 141701

А. Б. Сорока

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: antonova.en@genlab.llc
Россия, Долгопрудный, Московская область, 141701

О. Н. Митяева

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий

Email: antonova.en@genlab.llc
Россия, Долгопрудный, Московская область, 141701; Москва, 119991; Москва, 125315

П. Ю. Волчков

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Федеральный исследовательский центр оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий

Email: antonova.en@genlab.llc
Россия, Долгопрудный, Московская область, 141701; Москва, 119991; Москва, 125315

Список литературы

  1. Andreazzoli M., Barravecchia I., De Cesari C., Angeloni D., Demontis G.C. 2021. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3D-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. V. 10. Art. ID 2489. https://doi.org/10.3390/cells10092489
  2. Aslanidis A., Karlstetter M., Walczak Y., Jägle H., Langmann T. 2014. RETINA-specific expression of Kcnv2 is controlled by cone-rod homeobox (Crx) and neural retina leucine zipper (Nrl). Adv. Exp. Med. Biol. V. 801. P. 31. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3209-8_5
  3. Ail D., Malki H., Zin E.A., Dalkara D. 2023. Adeno-associated virus (AAV) – based gene therapies for retinal diseases: where are we? Ther. Adv. Chronic. Dis. V. 16. P. 111. https://doi.org/10.2147/TACG.S383453
  4. Barnard A.R., Tolmachova T., Seabra M.C., MacLaren R.E. 2012. Assessment of visual function by electroretinography following rAAV2-CHM/REP1 gene therapy in a mouse model of choroideremia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. V. 53. P. 1933. https://doi.org/10.1167/iovs.53.3.1933
  5. Brinkman E.K., Chen T., Amendola M., van Steensel B. 2014. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic. Acids. Res. V. 42. Art. ID e168. https://doi.org/10.1093/nar/gku1112
  6. Bruegmann T., Deecke K., Fladung M. 2019. Mediated genome editing in poplars: evaluating the efficiency of gRNAs in CRISPR/Cas9. Mol. Biol. Rep. V. 20: 3623. https://doi.org/10.1007/s11033-019-04952-8
  7. Carvalho L., Rashwan R., Lim X.R., Brunet A., Miller A.L., Bhatt Y., Fuller-Carter P. , Hunt D. 2023. Pre-clinical efficacy testing of AAV-based gene therapy for KCNV2-deficiency. Investigative Ophthalmol. Visual Sci. V. 64. P. 477. https://doi.org/10.1167/iovs.64.6.477
  8. Chen X., Xu F., Zhu C., Ji J., Zhou X., Feng X., Guang S. 2014. Dual sgRNA-directed gene knockout using CRISPR/Cas9 technology in Caenorhabditis elegans. Sci. Rep. V. 4. Art. ID 7581. https://doi.org/10.1038/srep07581
  9. Chirinskaite A.V., Rotov A.Y., Ermolaeva M.E., Tkachenko L.A., Vaganova A.N., Danilov L.G., Fedoseeva K.N., Kostin N.A., Sopova J.V., Firsov M.L., Leonova E.I. 2023. Does background matter? A comparative characterization of mouse models of autosomal retinitis pigmentosa rd1 and Pde6b-KO. Int. J. Mol. Sci. V. 24. Art. ID 17180. https://doi.org/10.3390/ijms242417180
  10. Czirjak G., Toth Z.E., Enyedi P. 2007. Characterization of the heteromeric potassium channel formed by kv2.1 and the retinal subunit kv8.2 in Xenopus oocytes. J. Neurophysiol. V. 98. P. 1213. https://doi.org/10.1152/jn.00093.2007
  11. Da Silva-Buttkus P., Spielmann N., Klein-Rodewald T., Schütt C., Aguilar-Pimentel A., Amarie O.V., Becker L., Calzada-Wack J., Garrett L., Gerlini R., Kraiger M., Leuchtenberger S., Östereicher M.A., Rathkolb B., Sanz-Moreno A., Stöger C., Hölter S.M., Seisenberger C., Marschall S., Fuchs H., Gailus-Durner V., Hrabě de Angelis M. 2023. Knockout mouse models as a resource for the study of rare diseases. Mamm. Genome. V. 34. P. 244. https://doi.org/10.1007/s00335-023-09986-z
  12. Gill J.S., Georgiou M., Kalitzeos A., Moore A.T., Michaelides M. 2019. Progressive cone and cone-rod dystrophies: clinical features, molecular genetics and prospects for therapy. Br. J. Ophthalmol. V. 103. P. 711. https://doi.org/10.1136/bjophthalmol-2018-312983
  13. Hart N.S., Mountford J.K., Voigt V., Fuller-Carter P., Barth M., Nerbonne J.M., Hunt D.M., Carvalho L.S. 2019. The role of the voltage-gated potassium channel proteins Kv8.2 and Kv2.1 in vision and retinal disease: insights from the study of mouse gene knock-out mutations. eNEURO. V. 6. Art. ID 0032. https://doi.org/10.1523/ENEURO.0032-19.2019
  14. Hunt D.M., Har N., Mountford J.K., Barth M., Fuller-Carter P., Carvalho L.S. 2018. Role of the voltage-gated potassium channel subunit Kv8.2 in inherited retinal disease and interaction with other channel proteins. ARVO Ann. Meeting Abstract. V. 59. Art. ID 2328. https://doi.org/10.1167/iovs.59.6.2328
  15. Jensen K.T., Floe L., Petersen T.S., Huang J., Xu F., Bolund L., Luo Y., Lin L. 2017. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Lett. V. 591. V. 1892. https://doi.org/10.1002/1873-3468.12694
  16. Liang G., Zhang H., Lou D., Yua D. 2016. Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Sci. Rep. V. 6. P. 21451. https://doi.org/10.1038/srep21451
  17. Maguire A.M., Bennett J., Aleman E.M., Leroy B.P., Aleman T.S. 2021. Clinical perspective: treating RPE65-associated retinal dystrophy. Mol. Ther. V. 29. P. 442. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.10.025
  18. Michaelides M., Hardcastle A.J., Hunt D.M., Moore A.T. 2006. Progressive cone and cone-rod dystrophies: phenotypes and underlying molecular genetic basis. Surv. Ophthalmol. V. 51. P. 232. https://doi.org/10.1016/j.survophthal.2006.02.008
  19. Michaelides M., Holder G.E., Webster A.R., Hunt D.M., Bird A.C., Fitzke F.W., Mollon J.D., Moore A.T. 2005. A detailed phenotypic study of “cone dystrophy with supernormal rod ERG”. Br. J. Ophthalmol. V. 89. P. 332. https://doi.org/10.1136/bjo.2004.047746
  20. Shahi P.K., Srinivasan A., Pattnaik B.R. 2022. A novel Kcnv2 nonsense mutation mouse model of cone dystrophy with supernormal rod response. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. V. 63. Art. ID 1784. https://doi.org/10.1167/iovs.63.6.1784
  21. Skarnes W.C., Rosen B., West A.P., Koutsourakis M., Bushell W., Iyer V., Mujica A.O., Thomas M., Harrow J., Cox T., Jackson D., Severin J., Fu J., Nefedov M., de Jong P. J., Stewart A.F., Bradley A. 2011. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. V. 474. P. 337. https://doi.org/10.1038/nature10163
  22. Uddin F., Rudin C.M., Sen T. 2020. CRISPR Gene therapy: applications, limitations, and implications for the future. Front. Oncol. V. 10. Art. ID 1387. https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01387
  23. Vincent A., Wright T., Garcia-Sanchez Y., Kisilak M., Campbell M., Westall C., Heon E. 2013. Phenotypic characteristics including in vivo cone photoreceptor mosaic in KCNV2-related “cone dystrophy with supernormal rod electroretinogram”. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. V. 54. P. 898. https://doi.org/10.1167/iovs.12-10664
  24. Wiles M.V., Qin W., Cheng A.W., Wang H. 2015. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design. Mamm. Genome. V. 26. P. 501. https://doi.org/10.1007/s00335-015-9579-0
  25. Wu H., Cowing J.A., Michaelides M., Wilkie S.E., Jeffery G., Jenkins S.A., Mester V., Bird A.C., Robson A.G., Holder G.E., Moore A.T., Hunt D.M., Webster A.R. 2006. Mutations in the gene KCNV2 encoding a voltage-gated potassium channel subunit cause “cone dystrophy with supernormal rod electroretinogram” in humans. Am. J. Hum. Genet. V. 79. P. 574. https://doi.org/10.1086/507885
  26. Wissinger B., Dangel S., Jagle H., Hansen L., Baumann B., Rudolph G., Wolf C., Bonin M., Koeppen K., Ladewig T., Kohl S., Zrenner E., Rosenberg T. 2008. Cone dystrophy with supernormal rod response is strictly associated with mutations in KCNV2. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. V. 49. P. 751. https://doi.org/10.1167/iovs.07-1038
  27. Zuker M., Stiegler P. 1981. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Res. V. 9. P. 133. https://doi.org/10.1093/nar/9.1.133

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема гена Kcnv2 с обозначенными сайтами узнавания гидами в программе SnapGene. Фиолетовым цветом показаны названия и расположения праймеров для амплификации области, охватывающей большую и маленькую делеции.

Скачать (39KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма по результатам ПЦР-скрининга клеток B16-F10. а – Большие делеции, б – маленькая делеция. (K–) – ПЦР-продукт из нетрансфицированных клеток (отрицательный контроль), М – маркер длин ДНК. Электрофорез в 1.5%- (а) и 3%-ном (б) агарозном геле.

Скачать (191KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Эффективность индукции делеций, полученная по результатам анализа электрофореграмм с помощью денситометрии в программе ImageJ.

Скачать (49KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Частоты инделов в диапазоне 10 нуклеотидов от предсказанного сайта разрезания. а –для гида gx/2, б – для гида g4.

Скачать (71KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Подтверждение маленькой делеции секвенированием по Сэнгеру. Хроматограмма, соответствующая делеции гидами g3/1–gx/2 (вверху), и контрольная хроматограмма, полученная из клеток без делеции (внизу).

Скачать (321KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Подтверждение больших делеций секвенированием по Сэнгеру. Верхние хроматограммы получены из фрагмента ДНК с делецией, а нижние – из фрагмента ДНК без делеции: а – gx/2–g4, б – g3/1–g6, в – gx/2–g6, г – g3/1–g4.

Скачать (6MB)
Метаданные
8. Рис. ДМ1. Плазмида (# 52961; Addgene, США). а – Схема, показывающая соответствие липких концов вектора и липких концов спаренных олигонуклеотидов; фиолетовым цветом выделены сайты узнавания рестриктазой BsmBI, зеленым – уникальная часть гида на примере гида g1. б – Карта плазмиды с обозначениями сайтов рестрикции BsmBI и вырезаемого продукта. в – Продукт рестрикции на электрофореграмме.

Скачать (322KB)
Метаданные
9. Рис. ДМ2. Электрофореграмма по результатам ПЦР-скрининга геномной ДНК с маленькими делециями, выделенной из клеток B16-F10. На электрофореграмме указаны пары гидов, используемые для создания маленькой делеции: g3/1 и g2/1, g2/1 и gx/2, g3/1 и gx/2, g4/1 и gx/2. М – маркер длин ДНК, K – отрицательный контроль.

Скачать (84KB)
Метаданные
10. Рис. ДМ3. Гель-электрофорез по результатам ПЦР-скрининга геномной ДНК с большими делециями, выделенной из клеток B16-F10. На электрофореграмме указаны пары гидов, используемые для создания большой делеции: g1–gx/24; g1–g3/1; g3–gx/2; g–g2/1; g3/1–g6; g1–g6; g3–g6; g3/1–g4; g1–g4; gx/2–g4; gx/2–g6; g3/1–g6. М – маркер длин ДНК, K – отрицательный контроль.

Скачать (221KB)
Метаданные
11. Рис. ДМ4. Вторичные структуры гидов, полученные в RNAfold Web Server. а – Вторичные структуры используемых гидов; б – вторичная структура с обозначениями RAR-шпилька (repeat and anti-repeat region – область повтор-анти-повтор), шпильки (stem loop) 1, 2 и 3, 20-нуклеотидная последовательность (Bruegmann et al., 2019).

Скачать (86KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024