The effect of hemodialysis on echocardiographic parameters and on supraventricular cardiac arrhythmias

Full Text

ДДЛЖ – диастолическая дисфункция левого желудочка

ЛЖ – левый желудочек

ЛП – левое предсердие

МЛЖ – масса левого желудочка

НПВ – нижняя полая вена

ОЛП – объем левого предсердия

ОПП – объем правого предсердия

ПП – правое предсердие

ФП – фибрилляция предсердий

ЭКГ – электрокардиограмма

ЭхоКГ – эхокардиография

Р′ – скорость движения митрального клапана в раннюю диастолу

Введение

Наджелудочковые нарушения ритма являются частой коморбидной патологией у пациентов, находящихся на гемодиализе. Также распространенность фибрилляции предсердий (ФП) в данной группе пациентов выше, чем в общей популяции. В исследовании M. Kloosterman и соавт. среди пациентов, находящихся на гемодиализе, распространенность персистирующей ФП составила 23,4% [1]. По данным метаанализа D. Zimmerman и соавт., ФП обнаружена у 27% пациентов, находящихся на диализе, и у 13,9% пациентов регистрировалась постоянная ФП. Из всех исследуемых 9,6% имели персистирующую форму и 3,5% – пароксизмальную ФП [2]. Частота возникновения ФП увеличивается с возрастом у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности с 9,3% в возрасте от 65–75 лет до 17% у пациентов старше 85 лет [3]. Нарушения кальциевого обмена у пациентов на диализе, увеличивающие риск сосудистой и клапанной кальцификации, могут быть частично ответственны за увеличение частоты развития клапанной или неклапанной ФП [4].

Согласно исследованиям возраст и увеличение объема левого предсердия (ОЛП) связаны с частотой возникновения ФП. Увеличение ОЛП считается независимым фактором риска ФП, инсульта и смерти [5]. Кроме того, считается, что увеличенный ОЛП также является маркером тяжелой и постоянной диастолической дисфункции левого желудочка (ДДЛЖ), особенно при отсутствии серьезных дефектов митрального клапана [6].

Достоверно известно, что размер ЛП является одним из основных факторов, предрасполагающих к возникновению аритмий. ОЛП, как показано, связан с частотой ФП. Поэтому в настоящее время объемные параметры стали широко используемыми показателями для оценки вероятности возникновения или рецидива аритмии. S. Shin и соавт. в своем исследовании показывают, что у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией связь между толщиной стенок ЛЖ и ОЛП является нелинейной при наличии сопутствующей пароксизмальной ФП [7]. Также есть исследования, говорящие о том, что размер ЛП является независимым прогностическим фактором при ФП, инфаркте миокарда и сердечной недостаточности [8].

ЛП влияет на наполнение ЛЖ за счет того, что выполняет резервуарную функцию в момент систолы желудочка и насосную в конце диастолы. Активный предсердный вклад становится особенно важным у лиц с ДДЛЖ. При ДДЛЖ доля предсердного вклада в трансмитральном притоке увеличивается. При отсутствии эффективного сокращения предсердия при ФП фракция выброса ЛЖ может значительно уменьшаться, вплоть до 15–20% [9]. Пациенты с гипертрофией ЛЖ, проходящие процедуру диализа, особенно плохо переносят объемную перегрузку, вызванную чрезмерной гидратацией, которая уменьшается после сеанса гемодиализа и может контролироваться при эхокардиографическом (ЭхоКГ) исследовании на основании измерения ширины нижней полой вены (НПВ). Интрадиалитическая гипотензия является одним из наиболее распространенных осложнений гемодиализа и обычно результатом чрезмерного удаления жидкости по отношению к объему плазмы. Поддержание постоянного объема циркулирующей крови во время диализа зависит от скорости заполнения внутрисосудистого пространства из внеклеточного интерстициального пространства. Уменьшение объема циркулирующей крови приводит к снижению как наполнения ЛЖ, так и сердечного выброса. Следовательно, падение артериального давления во время диализа является результатом дисбаланса между уменьшением объема плазмы в циркулирующей крови и компенсаторными гемодинамическими и нейрогормональными механизмами. В исследовании M. Heung и соавт. показано, что частота возникновения гипотензии во время диализа влияет на смертность в популяции пациентов, находящихся на диализе, и связана с увеличенной частотой пароксизмов ФП после диализа [10].

Цель исследования – проанализировать влияние сеанса диализа на параметры ЭхоКГ и оценить их связь с возникновением наджелудочковых нарушений ритма и ФП при процедуре гемодиализа.

Материал и методы

В работе приняли участие 78 пациентов (36 женщин, 42 мужчины). Все пациенты, набранные для участия в исследовании, предоставили свое информированное письменное согласие, одобренное локальным этическим комитетом при РостГМУ. На момент включения в исследование все пациенты находились на синусовом ритме и проходили процедуру поддерживающего гемодиализа не менее 6 мес. Критерии исключения: постоянный прием антиаритмической терапии, ранее имплантированные кардиостимуляторы, трансплантация сердца, госпитализация в связи с декомпенсацией хронических заболеваний, терминальные злокачественные образования, остаточная почечная функция, неадекватная доза диализа и наличие центрального венозного катетера.

Медикаментозная терапия у пациентов проводилась в соответствии с рекомендациями Европейского общества кардиологов (ESC 2016). â-Адреноблокаторы принимали 47 (60,3%) пациентов, блокаторы ренин-ангиотензин-альдостероновой системы – 62 (79,5%), дигидропиридиновые антагонисты кальция – 38 (48,7%), статины – 58 (74,3%), ингибиторы протонной помпы – 42 (53,8%), антиагреганты – 53 (67,9%), антикоагулянты по показаниям, не связанным с ФП, – 11 (14,1%). У 6 (7,7%) пациентов впервые обнаружены пароксизмы ФП и трепетания предсердий в момент мониторинга, что потребовало коррекции терапии. Оценивали: клиническое состояние, электрокардиограмму (ЭКГ), цветную допплеровскую трансторакальную эхокардиограмму и холтеровское мониторирование ЭКГ на протяжении 2 дней.

Мониторинг ЭКГ начинался перед стартом сессии диализа и прекращался через 2 дня – перед началом следующей процедуры. При анализе определяли наличие таких нарушений ритма, как: наличие одиночных суправентрикулярных экстрасистол, эпизодов брадикардии и пауз ритма, объединение 3 или более последовательных наджелудочковых экстрасистол, трепетания и ФП. Мониторирование проводили при помощи аппаратов Cardiomonitor ПО – ХМ ЭКГ (PADSY, Германия). Проанализированы эпизоды наджелудочковых нарушений ритма, периоды скрытой ишемии, вариабельность сердечного ритма. Также измерены сывороточные уровни натрия, калия, магния, кальция и бикарбоната в начале диализа.

ЭхоКГ-исследования выполнены у всех пациентов до и после сеанса диализа. Исследования проводили на аппаратах экспертного класса Phillips с использованием конвексного датчика врачом функциональной диагностики и записали для последующего просмотра и проверки. При проведении ЭхоКГ анализировались следующие данные:

• наличие гипертрофии ЛЖ;
• нарушения систолической и диастолической функции;
• размер ЛП;
• фракция выброса;
• масса ЛЖ (МЛЖ);
• ОЛП;
• ОПП;
• скорость трансмитрального потока в фазу пассивного (Е) и активного (А) наполнения желудочков;
• отношение скоростей пассивного и активного наполнения желудочков (Е/А);
• скорость движения митрального клапана в раннюю диастолу (Р′);
• отношение ранней диастолической скорости трансмитрального потока к ранней диастолической скорости движения митрального кольца (Е/Р′), время замедления волны.

Размеры ЛП измерены в диастолу в 3 позициях: парастернальная длинная ось (B-режим), апикальная 4- и 2-камерная. Все ЭхоКГ-изображения проанализированы одним исследователем и повторены для оценки изменчивости внутри наблюдателя.

Результаты выражали как среднее со стандартным отклонением (среднее ± SD) для непрерывных переменных с нормальным распределением. Категориальные переменные представлены в процентах, связанных с размером исследовательской группы. Тест Шапиро–Уилка использовался для проверки нормального распределения переменных. T-тест парных образцов использовался для сравнения 2 средних значений популяции в случае 2 выборок, которые коррелируют (до – после анализа). Тест МакНемара с коррекцией непрерывности использовался для понимания взаимосвязи между данными до и после диализа, в то время как критерий Мак-Немара (c²) проверял связь между переменными (ФП, ОЛП). ОЛП>32 мм и ОПП>30 мм использованы в качестве порогового значения. Коэффициент корреляции Пирсона использован для анализа взаимосвязи между МЛЖ и ОЛП, а также между ОЛП и шириной НПВ. Значение p<0,05 считали значимым. Расчеты сделаны с использованием Statistica 10.

Результаты

Среди пациентов, включенных в исследование, артериальная гипертензия являлась наиболее распространенной этиологией почечной недостаточности, за ней следовали сахарный диабет и гломерулонефрит. 64,1% пациентов страдали от артериальной гипертензии, у 42% диагностирован сахарный диабет, у 41% из них – нарушения липидного обмена. Средняя длительность диализа составляла 56 мес (диапазон: 3–120 мес); табл. 1.

Таблица 1. Характеристика пациентов включенных в исследование групп
Параметр	Все пациенты (n=78)	Группа без наджелудочковых нарушений ритма (n=35)	Группа с наджелудочковыми нарушениями ритма (n=43)	p
Возраст, лет	58,6±10,89	54,4±4,6	62,2±5,8	0,001
Пол, м/ж	42/36	19/16	23/20	0,56
Длительность диализа, мес	56 [14–105]	40 [18–96]	59 [11–114]	0,88
Гипертензия, %	64,1 (50)	77,14 (27)	53,48 (23)	0,56
Диабет, %	35,89 (28)	34.28 (12)	37,2 (16)	0,15
Хроническая сердечная недостаточность, %	44,58 (34)	42.85 (15)	44,18 (19)	0,74
Дислипидемии, %	39,74 (31)	34,28 (12)	44,18 (19)	0,71
Индекс массы тела, кг/м2	24,5±4	25±5	24±3	0,40
Инсульт, %	10,25	5,88	13,04	0,97
Фракция выброса, %	60,2±13,0	63,4±12,4	57,4±13,1	0,07
Диастолическая дисфункция, %	48,71 (38)	45,57 (17)	48,83 (21)	0,71
Легочная гипертензия, %	17,9	17,14	16,28	0,59

Примечание. Данные представлены в виде средних ± SD (медиана [25–75%]) значениях или процентах.

 

По данным суточного мониторирования ЭКГ: у 56 (69%) пациентов обнаружена частая предсердная экстрасистолия. При временном анализе чаще предсердная экстрасистолия встречалась во время фазы процедуры гемодиализа (3,0±11, 2,0±6,9, 1,5±5,2, и 1,1±4,1 на 1 тыс. сердечных сокращений/фаза процедуры гемодиализа, ранняя фаза после гемодиализа, поздняя фаза, фаза перед диализом). Пациенты с предсердной экстрасистолией были значительно старше, чем пациенты без нее (61,2±5,4 года против 53,7±6,9 года соответственно; p<001). Хотя у этих 2 групп нет достоверных различий по полу, этиологии почечной недостаточности, наличию артериальной гипертонии, сахарного диабета и дислипидемиям, продолжительность диализной терапии (79,2±52,8 мес против 50,4±26,4 мес соответственно; p<0,005) выше у пациентов с предсердной экстрасистолией. Пароксизмы ФП отмечались у 40 (51,2%) пациентов. Всего зарегистрировано 94 пароксизма ФП, из них 36 – до процедуры диализа и 58 – после окончания процедуры. Все приступы ФП имели пароксизмальный характер и терминировались самостоятельно.

Из лабораторных данных уровень калия в сыворотке оказался ниже в группе пациентов с предсердными экстрасистолами (3,2±0,2 ммоль/л против 4,9±0,3 ммоль/л; p<0,05). Достоверных различий по другим лабораторным анализам между этими 2 группами не получили.

Табл. 2 демонстрирует ЭхоКГ-параметры пациентов, включенных в исследование до и после процедуры гемодиализа. Анализ различий ЭхоКГ-параметров показал значительно больший ОЛП, ОПП, ширину НПВ и параметр Р’ до диализа по сравнению с их состоянием после диализа (см. табл. 2).

Таблица 2. ЭхоКГ-параметры до и после диализа
Параметр	Среднее значение ± SD до процедуры диализа	Среднее значение ± SD после процедуры диализа	p
Е/Р′	10,98±5,28	10,01±4,36	NS (0,280)
ОЛП	43,46±4,19	30,82±2,92	<0,0001
Е/А	1,14±0,66	0,95±0,41	NS (0,852)
Р′	12,06±0,26	9,55±0,23	0,025
ОПП	34,66±1,56	26,08±2,49	0,0162
Ширина НПВ	24,45±1,53	13,95±1,53	<0,00001

Примечание. Е/Р′ – отношение ранней диастолической скорости трансмитрального потока к ранней диастолической скорости движения митрального кольца, Е/А – отношение скоростей пассивного и активного наполнения желудочков. При анализе данных ЭхоКГ до и после диализа достоверными оказались различия ширины НПВ и ОЛП; p<0,05.

 

При анализе различий между данными до и после проведения процедуры диализа приступы ФП случались чаще после диализа, когда ОЛП>32 мм (предельное значение) и ОПП>30 мм наблюдались значительно чаще у пациентов до диализа. Результаты демонстрирует табл. 3.

Таблица 3. Возникновение ФП во время процедуры диализа (тест МакНемара)
	До процедуры диализа, n (%)	После процедуры диализа, n (%)	p
ФП (n=94)	36 (38,29)	58 (61,71)	0,037
ОЛП>32 (n=31)	61 (78,2)	28 (35,89)	0,0005
ОПП>30 (n=39)	69 (88,46)	18 (23,07)	0,0024
ФП+ОЛП >32 (n=39)	26 (33,3)	22 (28,2)	NS (0,823)
ФП+ОПП >30 (n=39)	22 (28,2)	10 (12,82)	NS (0,987)

При сравнении показателей до и после диализа обнаружили, что частота встречаемости ФП у пациентов после диализа значительно выше по сравнению с состоянием перед диализом (36,0 против 58; p<0,0371). Также показано, что ОЛП и ОПП у пациентов до диализа были достоверно выше, чем после диализа. Достоверной связи между частотой возникновения ФП при ОЛП>32 мл и ОПП>30 мл до и после диализа не обнаружили.

Далее проводился анализ взаимосвязи между частотой возникновения приступов ФП до и после диализа и уменьшением объемов ПП (ÄОПП) и ЛП (ÄОЛП) после диализа относительно преддиализных значений. При анализе оценивалась взаимосвязь наличия пароксизмов ФП до и после диализа у пациентов с ÄОПП>5 мм и ÄОЛП>7 мм. Результаты демонстрирует табл. 4.

Таблица 4. Наличие пароксизмов ФП до и после диализа у пациентов с постдиализным уменьшением объема ПП (ÄОПП)>5 мм и уменьшением объема ЛП (ÄОЛП)>7 мм (тест МакНемара)
	До процедуры диализа, n (%)	После процедуры диализа, n (%)	p
Пациентов с ФП (n=40)	8 (20)	37 (92,5)	0,024
ФП при ÄОЛП>7	6 (7,69)	24 (30,76)	0,042
ФП при ÄОПП>5	8 (10,2)	28 (35,89)	<0,005

При проведенном анализе обнаружена связь между увеличенным количеством пароксизмов ФП и уменьшением ОПП и ОЛП после диализа.

Также проанализирована взаимосвязь между МЛЖ и ОЛП, однако никакой существенной корреляции не наблюдали. Наблюдали положительную корреляцию между ОЛП и шириной НПВ (табл. 5).

Таблица 5. Взаимосвязь между МЛЖ, шириной НПВ и ОЛП (коэффициент корреляции Пирсона)
До процедуры диализа (n=78)	МЛЖ	p
ОЛП	R 0,114	NS (0,490)
До процедуры диализа (n=78)	Ширина НПВ	p
ОЛП	R 0,0027	NS (0,987)

При анализе взаимосвязи между МЛЖ и ОЛП существенной корреляции не обнаружили. Наблюдалась положительная корреляция между ОЛП и шириной НПВ, что говорит о системной перегрузке сосудистого русла объемом в преддиализный период.

Обсуждение

ФП у пациентов на гемодиализе связана с повышенной заболеваемостью и смертностью. Такое учащение возникновения ФП может быть обусловлено и общими факторами риска ФП, и уникальными для почечной патологии или диализ-специфическими факторами [11]. По данным нашего исследования у 56 (71,7%) пациентов обнаружена частая предсердная экстрасистолия. Пароксизмы ФП отмечались у 40 (51,28%) пациентов, что выше средних показателей популяции и подтверждает наличие дополнительных факторов риска ФП у данных пациентов [12]. Высказано предположение, что фиброз миокарда, развивающийся после частой перегрузки и перерастяжения предсердий, может быть ответственным за развитие ФП, однако существуют исследования, говорящие, что фиброз миокарда в предсердиях и желудочках связан с повышенной концентрацией ангиотензина II и альдостерона и что этот процесс не зависит от перегрузки давлением и гипертрофии ЛЖ у данной группы больных [13]. Несмотря на опубликованные данные, механизмы взаимосвязи между нарушениями ритма, особенно мерцательной аритмией и диализной терапией, остаются неясными. Таким образом, знание точных сроков начала ФП в отношении самой процедуры диализа может быть ценным источником данных о лежащем в основе механизме [14].

В нашем исследовании продемонстрирована значительно более высокая частота приступов ФП у пациентов после диализа в сравнении с состоянием до диализа (36 против 58; p<0,0371). Данный результат совпадает с данными N. Hassanin и соавт., где проведение самой процедуры диализа связано с увеличенным риском развития ФП [15]. Они предложили 2 механизма, которые могут быть вовлечены в эту взаимосвязь. Согласно их гипотезе объема, перегрузка объемом и истощение внутрисосудистого объема являются ключевыми факторами, участвующими в развитии мерцательной аритмии. По нашим данным обнаружена взаимосвязь между развитием приступов ФП после диализа и уменьшением объема ПП (ÄОПП)>5 мм и объема ЛП (ÄОЛП)>7 мм после процедуры, что подтверждает литературные данные и позволяет предположить, что изменение объемных показателей предсердий вследствие процедуры диализа может выступать инициирующим фактором ФП. Вторая гипотеза указывает на смещение электролитов как основной триггер ФП у пациентов на диализе, что как предположение встречается и в других публикациях [16]. В наших же данных обнаружена только взаимосвязь количества предсердных экстрасистол с уровнем калия сыворотки крови до диализа, достоверных различий по другим лабораторным анализам не получили. Также мы обнаружили, что 9 из 10 наблюдаемых эпизодов предсердной аритмии начались в течение последнего часа процедуры диализа. В литературе увеличенную частоту наджелудочковых нарушений ритма в последний час гемодиализа связывают со значительным снижением внутрисердечного диастолического и систолического давления во время диализа [17]. По данным H. Koomans и соавт. данное снижение внутрисосудистого давления в свою очередь приводит к ингибированию барорефлекса, симпатической активации и высвобождению катехоламинов, тем самым процедура диализа может провоцировать приступы ФП за счет рефлекторной реакции [18].

Увеличение ОЛП обычно наблюдается у пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности независимо от типа заместительной почечной терапии. R. Patel и соавт. в своем исследовании продемонстрировали корреляцию между летальными и нелетальными сердечно-сосудистыми событиями у пациентов, находящихся на гемодиализе, и ОЛП, а также выявили, что индекс ОЛП является независимым предиктором смертности в данной группе пациентов [14].

В нашем исследовании процедура диализа связана со значительным уменьшением ОЛП, ОПП, ширины НПВ и параметра Р’ после диализа по сравнению с состоянием перед диализом. Объемная перегрузка, которая обычно наблюдается при почечной патологии, отрицательно влияет на диастолическую функцию и, как следствие, на систолическую функцию ЛЖ и ЛП [11]. Увеличение ОЛП является основным показателем ремоделирования ЛП у пациентов, находящихся на диализе. ЛП-ремоделирование является зависимым от времени адаптивным ответом миоцитов, направленным на поддержание текущего баланса, несмотря на воздействие неблагоприятных стрессорных факторов. Увеличение объема ЛП сопровождается нарушением его гемодинамической функции [19]. Согласно исследованиям ЛП играет важную роль в поддержании оптимального сердечного выброса, несмотря на нарушение расслабления ЛЖ и снижение комплаентности ЛЖ у пациентов, находящихся на гемодиализе [15]. В данной конкретной группе пациентов ДДЛЖ, гипертрофия и перегрузка объемом могут привести к увеличению давления наполнения ЛЖ и, как следствие, запуску компенсаторного механизма в ЛП, включая дилатацию ЛП [15]. Ремоделирование ЛП при терминальной почечной недостаточности, наряду с утолщением стенки ЛП и очаговым отложением коллагена, способствует развитию фиброза в миокарде предсердия [13]. В нашем исследовании мы наблюдали, что ОЛП, превышающий 32 мм (предельное значение), обнаруживался значительно чаще у пациентов до диализа, чем после, что согласуется с результатами других исследований и доказывает, что ЛП подвержено изменениям преднагрузки и что преднагрузка является максимально низкой сразу после гемодиализа, а затем увеличивается к началу следующей процедуры [11–18].

Также мы проанализировали взаимосвязь между массой ЛЖ и ОЛП, но никакой существенной корреляции не наблюдали. Аналогично в исследовании R. Patel и соавт. [14] значимой корреляции между ОЛП и МЛЖ не наблюдали, это свидетельствует о том, что увеличение массы ЛЖ – не только результат нарушения насосной и резервуарной функции ЛП, но и отражение долгосрочных эффектов увеличенного давления наполнения желудочков.

Пациенты, проходящие процедуру гемодиализа, находятся в группе риска развития аритмий из-за неблагоприятных эффектов диализа. Проведение гемодиализа обычно является критерием исключения из исследований, и поэтому данная группа пациентов изучается относительно слабо. ФП является значимой проблемой, особенно у пациентов, находящихся на диализе. Своевременное выявление и профилактика ФП должны стать одним из обязательных аспектов работы кардиологов с больными на гемодиализе и всегда должны быть связаны со своевременным назначением антикоагулянтной терапии из-за высокого риска тромбоэмболических осложнений, особенно при сосудистом доступе.

Выводы

1. Пожилой возраст и длительность диализной терапии у пациентов на гемодиализе приводят к повышенному риску возникновения ФП.
2. Уменьшение ОПП и ОЛП после процедуры гемодиализа имеет положительную корреляционную связь с пароксизмальной ФП.
3. Процедура гемодиализа приводит к уменьшению ОПП и ОЛП, а также ширине НПВ и снижению скорости движения митрального клапана в раннюю диастолу.
4. Не обнаружили взаимосвязи между ОЛП и массой миокарда ЛЖ у пациентов, находящихся на гемодиализе.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare that there is not conflict of interests.

About the authors

Oleg V. Likhachev-Mishchenko

Rostov Regional Clinical Hospital

Author for correspondence.
Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-6271-2711

doctor, cardiovascular surgeon

Russian Federation

Alexey A. Kornienko

Rostov Regional Clinical Hospital

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-8476-665X

канд. мед. наук, зав. отд-нием ХЛСНРС и ЭКС

Russian Federation

Larisa A. Khaisheva

Rostov State Medical University

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2419-4319

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

Anastasia V. Duzhikova

Rostov Regional Clinical Hospital

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4112-9295

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation

Natalia A. Kornienko

Rostov Regional Clinical Hospital

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-0485-5869

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation

Eduard G. Kadyan

Rostov State Medical University

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2495-5365

Medical Resident

Russian Federation

Alexander A. Dyuzhikov

Rostov Regional Clinical Hospital

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-6400-8904

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

Sergey V. Shlyk

Rostov State Medical University

Email: gelo2007@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-5817-8149

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

References

Supplementary files