Diagnostic value of chaperone activity of heat shock proteins 70 in coronary atherosclerosis

Full Text

Введение Основным компонентом развития ишемической болезни сердца является коронарный атеросклероз [1, 2]. Представление о том, что в патогенезе атеросклероза участвуют иммунные комплексы, было выдвинуто G. Wick и соавт., и знание о том, что окисленные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) токсичны для эндотелиальных клеток, побудило исследовать природу иммунной реактивности, индуцированной окисленными ЛПНП, и пролиферацию гладкомышечных клеток в артериальных стенках [3]. В последние годы было получено значительное представление об участии врожденной и адаптивной иммунной реактивности в атеросклерозе, а также о роли белков теплового шока (БТШ) 60, 70 и 90 семейств в патогенезе заболевания [4]. БТШ70 ослабляют активацию NF-kB, что предполагает противовоспалительную активность данных БТШ [5]. Установлено, что шаперонная активность БТШ70 в плазме крови имеет обратную ассоциацию с тяжестью атеросклероза [6]. Установлено, что высокий уровень холестерина снижает шаперонную активность БТШ70 [7]. Про- и антиатерогенные эффекты БТШ70 в настоящее время являются предметом обсуждения [8]. В связи с этим становится актуальным изучение роли шаперонной активности в патогенезе и диагностике коронарного атеросклероза. Цель исследования - изучение роли шаперонной активности БТШ70 в патогенезе и диагностике коронарного атеросклероза. Материалы и методы Материалом для исследования стало обследование 354 пациентов с диагнозом «ишемическая болезнь сердца», верифицированного стандартизированными валидизированными критериями и клинико-функциональными методами, в том числе 175 женщин и 179 мужчин в возрасте от 47 до 75 лет, средний возраст 61,8±8,1 года, находившихся на лечении в кардиологическом отделении №2 БУЗ ВО ВГКБСМП №1. Всем пациентам в стационаре проводился полный спектр обследования с определением показателей липидного профиля. Наличие коронарного атеросклероза у пациентов подтверждалось проведением коронароангиографии по методике Judkins (1967 г.). Исследование проводилось при помощи ангиографической системы General Electric Innova-3100 (GE Healthcare, США). Доступ осуществлялся правым трансфеморальным доступом по Seldinger. Тяжесть коронарного атеросклероза определяли на основании индекса Gensini. Индекс Gensini определяется как сумма произведений индекса тяжести каждого стеноза и индекса функционального значения, рассчитанного для каждого сегмента коронарных артерий [9]. По индексу Gensini пациенты были разделены на 2 группы: GS0 - 152 пациента без признаков коронарного атеросклероза (необструктивное поражение коронарных артерий), GS1 - 202 пациента с поражением коронарного русла. Шаперонную активность определяли с помощью добавления к раствору фосфатного буфера (1,6 мл), инсулина (50 мкл) и дитиотреитола (50 мкл), далее к полученному раствору добавляли 2,5 мкл сыворотки (производитель Cloud-Clone Corp.). Затем пробу нагревали до температуры 42°С. Регистрация шаперонной активности проводилась методом динамического светорассеяния при длине волны 430 нм на приборе Spekol Carl Zeiss Jena с термостатируемой приставкой ЕК-5 путем построения кинетической кривой с лаг-периодом, измерения проводились в процентах [10]. Определение окислительной модификации белков в сыворотке крови проводили по методике Дубининой [11]. Оптическую плотность 2,4-динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-36: при длине волны 356 и 370 нм определялось содержание альдегидо- и кетонопроизводных динитрофенилгидразонов нейтрального характера (АДФГн и КДФГн), при длине волны 430 и 530 нм - альдегидо- и кетонопроизводных основного характера (АДФГо и КДФГо). Активность супероксиддисмутазы определяли спектрофотометрическим методом с расчетом процента гашения. Для определения уровня гомоцистеина использовали тест-систему для количественного определения общего L-гомоцистеина в человеческой сыворотке или плазме (фирма-производитель Axis-Shield). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакетов программ SPSS Statistics 20. Различия между группами определялись с помощью критерия Манна-Уитни (достоверные различия при p<0,05). Описание признаков с распределением, отличным от нормального, представлено в виде Me [Q25; Q75], где Ме - медиана, Q25 и Q75 - 25 и 75-й квартили. Для сравнения качественных признаков использовался c2-критерий Пирсона. Для оценки корреляционных связей между параметрами использовался критерий Спирмена. Коэффициент корреляции считался значимым при p<0,05. Для оценки вероятности обнаружения коронарного атеросклероза применяли линейный регрессионный анализ. Шансом в каждой группе пациентов называли вероятность наличия исследуемого признака к вероятности его отсутствия. Чувствительность и специфичность маркера определяли при помощи ROC-анализа. Результаты При наличии коронарного атеросклероза значение шаперонной активности БТШ70 оказалось в среднем на 22,8% выше относительно второй группы больных без признаков поражения артерий сердца по данным коронароангиографии. Сравнение значений шаперонной активности БТШ70 в этих группах выявило значимые различия по U-критерию Манна-Уитни: шаперонная активность БТШ70 в первой группе составила 58,85 [50, 61; 66, 83], а во второй - 76,25 [72, 83; 82, 77] (U=2431,5, р=7,1E-42). Распределение пациентов по показателю шаперонной активности БТШ70 послужило основанием для определения ориентировочного порогового значения на границе 68%, так как именно при этом значении и ниже резко возрастает частота встречаемости пациентов с признаками коронарного атеросклероза и снижается частота встречаемости больных с ишемической болезнью сердца без поражения коронарных артерий (рис. 1, 2). При анализе таблиц Оценка относительного риска (ОR) коронарного атеросклероза в таблицах сопряженности показала отношение шансов для уровня шаперонной активности БТШ70≤68%=64,664 (доверительный интервал - ДИ 32,830-127,366), относительный риск OR1 для когорты «шаперонная активность БТШ70>69%» составил 7,283 (ДИ 5,027-10,551), OR2 для когорты «шаперонная активность БТШ70≤68%» составил 0,113 (ДИ 0,069-0,183). Таким образом, шанс найти больных с шаперонной активностью БТШ70≤68% среди лиц с признаками коронарного атеросклероза высокий и составляет 7,283, а среди пациентов без поражения коронарных артерий крайне мал и составляет 0,113. С целью подтверждения значимости шаперонной активности БТШ70 в патогенезе коронарного атеросклероза выполнен корреляционный анализ Спирмена с расчетом коэффициентов ранговой корреляции. Выявлена высокая отрицательная корреляционная взаимосвязь между уровнем шаперонной активности БТШ70 и индексом Gensini (r=-0,840, р<0,0001). Выявленные закономерности подтверждают роль шаперонной активности БТШ70 в формировании атеросклероза коронарных артерий. С целью определения значимости шаперонной активности БТШ70 и ее места среди традиционных и биохимических патогенетических факторов развития и прогрессирования атеросклероза артерий сердца был проведен многофакторный линейный регрессионный анализ. В качестве зависимой переменной выступило значение GS, рассчитанное для каждого больного, а в качестве независимых переменных в регрессионную модель ступенчатым методом включались следующие параметры: мужской пол, возраст (лет), индекс массы тела (кг/м2), окружность талии (см), уровень систолического и диастолического артериального давления (мм рт. ст.), курение, наличие перенесенного в анамнезе инфаркта миокарда, общий холестерин (ммоль/л), триглицериды (ммоль/л), ЛПНП (ммоль/л), липопротеины высокой плотности - ЛПВП (ммоль/л), уровень гомоцистеина сыворотки крови (мкмоль/л), С-реактивный белок (мг/л), шаперонная активность (%), маркеры окислительного стресса: АДФГн (усл. Ед/мг), КДФГн (усл. Ед/мг), АДФГо (усл. Ед/мг), КДФГо (усл. Ед/мг), супероксиддисмутаза (%). Первой переменной в уравнение регрессии была включена шаперонная активность, что говорит о ее высокой прогностической значимости среди представленных показателей. Пошаговая итерация закончилась на 5-й итерации. В модель-5 оказались включены шаперонная активность БТШ70, гомоцистеин, ЛПНП, окружность талии, КДФГо. Достоверность корреляционных связей подтвердили выявленные в данной модели GLM (р<0,05) ассоциации указанных биомаркеров и окружности талии с фактом наличия коронарного атеросклероза (табл. 1). Скорректированный R2 для этой модели составил 78,5%, F=39,025, р<0,0001. Как видно из табл. 1, модуль стандартизированного коэффициента регрессии для шаперонной активности БТШ70 в рамках данной модели самый высокий, что подтверждает высокий уровень взаимосвязи шаперонной активности БТШ70 и коронарного атеросклероза. трицательное значение коэффициентов регрессии шаперонной активности БТШ70 говорит о том, что чем выше выраженность коронарного атеросклероза, тем ниже уровень шаперонной активности БТШ70. Такой высокий уровень взаимосвязи шаперонной активности БТШ70 и коронарного атеросклероза в рамках данных регрессионных моделей позволил сделать предположение о возможности создания упрощенной модели диагностики исключительно на основе определения шаперонной активности БТШ70. Был применен метод ROC-анализа для определения диагностической ценности шаперонной активности БТШ70, где в качестве одного независимого предиктора коронарного атеросклероза выступил уровень шаперонной активности БТШ70. Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,929±0,014, 95% ДИ 0,888-0,947 при z=29,63, p<0,0001 (рис. 3). Согласно экспертной шкале оценки площади под кривой прогностическая способность данной модели была оценена как отличная. По характеристической кривой было определено оптимальное пороговое значение, соответствующее требованию о максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели. Оно составило 68,46%. Таким образом, при уровне шаперонной активности БТШ70 равном или меньше 68,46% модель предсказывает наличие поражения коронарных артерий с диагностической чувствительностью 87,13% и специфичностью 90,76%. Представленная модель прогнозирования диагностики коронарного атеросклероза по уровню шаперонной активности БТШ70 при выбранном пороге отсечения 68,46% и менее демонстрирует хорошие характеристики: высокие чувствительность и специфичность, низкое отношение правдоподобия отрицательного результата и высокое положительного результата, высокую положительную прогностическую ценность и несколько меньшую отрицательную, что допустимо с учетом тяжести прогнозируемого положительного состояния наличия коронарного атеросклероза (табл. 2). Обсуждение Выявление пациентов с ранним развитием коронарного атеросклероза остается глобальной проблемой. В связи с этим актуальным представляется более детальное изучение развития данного состояния. Шаперонная активность - это способность БТШ сыворотки крови связываться с поврежденными или восстановленными белковыми молекулами, а также транспортировать их через внутриклеточные мембраны и экспонировать их белокмодифицирующими системами [12]. В нашем исследовании установлены снижение уровня шаперонной активности при наличии коронарного атеросклероза, а также значимая взаимосвязь с индексом Gensini. В ряде работ показано наличие взаимосвязи между БТШ70, которые и обладают шаперонной активностью, и сердечно-сосудистыми заболеваниями [12]. В экспериментальных работах установлено, что гиперэкспрессия шаперонов защищает сердце от ишемического и реперфузионного повреждения, а снижение экспрессии увеличивает гибель кардиомиоцитов [13]. Рандомизированное исследование (E. Dulin и соавт., 2010) продемонстрировало, что внеклеточные БТШ были значительно ниже в популяции с атеросклерозом и что оба белка могут служить в качестве биомаркеров для прогрессирования атеросклеротического заболевания [14]. Выводы В ходе исследования выявлены достоверные различия между группами с коронарным атеросклерозом и без него по уровню шаперонной активности БТШ70. Определена достоверная взаимосвязь между уровнем шаперонной активности БТШ70 и выраженностью коронарного атеросклероза. Выявленный порог шаперонной активности БТШ70 может рассматриваться в качестве возможного маркера выраженности коронарного атеросклероза. Финансовая поддержка. Научная работа выполнена на средства гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук (грант №МК-552.2018.7). Sources of funding. This work was partially supported by the Council on Grants of the President of the Russian Federation for the state support of young scientists (Grant MK-552.2018.7). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. The authors declare that there is not conflict of interests.

About the authors

Julia A. Kotova

Burdenko Voronezh State Medical University

Email: kotova_u@inbox.ru
Voronezh, Russia

Anna A. Zuikova

Burdenko Voronezh State Medical University

D. Sci. (Med.), Prof. Voronezh, Russia

Alexander N. Pashkov

Burdenko Voronezh State Medical University

D. Sci. (Biol.), Prof. Voronezh, Russia

References

Supplementary files