Association of polymorphism -1171 5A/6A of the matrix metalloproteinase gene type 3 (rs35068180) with dilated cardiomyopathy

Full Text

Введение

Этиология и патогенез развития дилатации миокарда изучаются активно [1]. Благодаря этому классификация кардиомиопатий динамически пополняется и уточняется [2]. Распространенность дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) в разных популяциях различна. Регистрируется от 5 до 10 случаев ДКМП на 100 тыс. населения [3]. Причем в настоящее время доказано, что клинические проявления ДКМП определяются мутациями в различных генах и их композициях [4]. Одним из таких исследуемых генов является ген матриксной металлопротеиназы 3-го типа (MMP-3). Полиморфизм -1171 5А/6А гена ММР-3 – это вставка/делеция A в положении 1171 в промоторе гена MMP-3 [5]. Полиморфный вариант 5А/6А гена ММР-3 определяет количественное значение ММР-3. Согласно литературным данным, MMP-3 участвует в процессах ремоделирования тканей и патологических процессах [6]. Мишенью экспрессии MMP-3 является миокард [7]. MMP-3 является активным участником деградации внеклеточного матрикса сердца, что в дальнейшем играет важную роль в ремоделировании сердечной мышцы [8]. Ряд исследователей доказали роль проколлагеназы 1 в активации ММР-3 [10].

Именно разрушение внеклеточного матрикса проколлагеназами в определенной степени способствует формированию целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний [12, 13], таких как острый коронарный сидром [14, 15], атеросклероз и рестеноз [16].

Цель исследования – изучить ассоциацию полиморфизма -1171 5А/ гена MMP-3 с дилатационной кардиомиопатией различного генеза.

Материал и методы

В исследование включили 221 больного с дилатацией миокарда ишемического генеза и идиопатической кардиомиопатией, средний возраст – 55,30±9,69 года, минимальные значения возраста – 20 лет, максимальные значения возраста – 77 лет. Среди больных – группа пациентов с дилатацией миокарда ишемического генеза (111 человек): 99 (89,2%) мужчин и 12 (10,8%) женщин. Из 221 больного у 110 пациентов не удалось верифицировать причину дилатации миокарда – идиопатическую дилатационную кардиомиопатию. В данной группе мужчин было 100 (91,5%), женщин – 10 (8,5%). Контрольная группа нашего исследования представлена 221 здоровым человеком (200 мужчин и 21 женщина) без заболеваний сердечно-сосудистой системы. Средний возраст пациентов контрольной группы – 53,6±4,8 года. Всем пациентам основной группы проводились рутинные лабораторные, инструментальные методы обследования, а также коронарография, при подозрении на миокардит – магнитно-резонансная томография сердца.

У всех пациентов брали биологический материал (венозная кровь) для молекулярно-генетического анализа. Для получения ДНК применяли метод фенол-хлороформной экстракции. Идентификация полиморфизма -1171 5A/6A гена ММР-3 осуществлялась с помощью метода полимеразной цепной реакции с полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов [17]. Исследование выполнили в лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний НИИТПМ – филиал ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск). Использовали следующие праймеры (Сибэнзим): прямой 5’-GATTACAGACATGGGTCACA-3’, обратный 5’-TTTCAATCAGGACAAGACGAAGTTT-3’ Смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл включала: трис-HCI (pH 9,0) 75 мM, (NH₄)₂ SO₄ 20 мM, Тween-20 0,01%, каждого праймера по 2 мкM, по 0,2 мМ раствора каждого из четырех dNTP, MgCI₂ 2,5 мM, 1,0 единиц Тag полимеразы, 0,5 мкг ДНК. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 95°С/30 с, 52°С/30 с, 72°С/30 с – 30 циклов. Визуализация продукта длиной 120 пн проводилась после электрофореза в 4% полиакриламидном геле и окраски бромистым этидием. На следующем этапе к амплификату добавляли 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Mrox I (Сибэнзим). Рестрикцию проводили при 37°C не менее 8 ч. Продукт амплификации при наличии 5А аллеля разрезается на два фрагмента 97 и 23 пн. Визуализация продуктов проводилась после электрофореза в 6% полиакриламидном геле.

Пакет статистических программ Statistica v. 7.0 использован для обработки полученного материала. Распределение частот генотипов полиморфизма -1171 5A/6A гена ММР-3 в контрольной выборке соответствовало распределению Харди–Вайнберга (÷²=0,6977). Маркеры гена MMP-3 с риском развития кардиомиопатии верифицировали, используя отношение шансов (ОШ) и его 95% доверительный интервал (ДИ). Заключение об отсутствии ассоциативной связи прописывали при ОШ равном 1, ОШ более 1 указывало на положительную ассоциативную связь аллеля или генотипа с кардиомиопатиями, при ОШ менее 1, т.е. при отрицательной ассоциативной связи аллеля или генотипа с кардиомиопатиями верифицировали «протективный фактор» заболевания.

Данная работа одобрена Этическим комитетом ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» от 07.2016. Исследование соответствует принципам Хельсинкской декларации. Каждый пациент перед началом исследования подписывал добровольное информированное согласие. Проведение исследования также одобрено локальным Этическим комитетом НИИТПМ – филиал ИЦиГ СО РАН. Все лица контрольной группы давали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Результаты

Для выявления генетической основы подверженности полиморфизма 5A/6A гена MMP-3 -1171 в развитии ДКМП мы сравнивали частоту генотипов и аллелей по принципу «случай–контроль» у 221 пациента с диагнозом ДКМП и 221 условно здорового пациента (табл. 1).

Таблица 1. Анализ ассоциаций полиморфизма 5A/6A гена MMP-3 -1171 среди больных с ДКМП и здоровых пациентов
Полиморфный аллельный вариант	ДКМП (n=221)		Контроль (n=221)		р
	абс.	%	абс.	%
6А/6А	93	42,1	72	32,6	0,39
5А/6А	105	47,5	118	53,4	0,464
5А/5А	23	10,4	31	14,0	0,247
Итог	221	100,0	221	100,0
Аллели	абс.	%	абс.	%
Аллель 6А	291	65,8	262	59,3	0,044
Аллель 5А	151	34,2	180	40,7
Итог	442	100,0	442	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	1,324 [1, 007–1, 740]
6A/6A	93	42,1	72	32,6	0,039
5A/6A+5A/5A	128	57,9	149	67,4
Итог	221	100,0	221	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	1,504 [1, 020–2, 216]

Гетерозиготный генотип 5A/6A у пациентов с ДКМП верифицирован в наибольшем проценте случаев – 47,5%, гомозиготный генотип 6A/6A среди больных с ДКМП – 42,1%, редкий гомозиготный генотип 5A/5A – 10,4%. В контрольной группе максимальное количество пациентов соответствовало гетерозиготному генотипу 5A/6A – 53,4%. Соотношение гомозиготного генотипа по распространенному аллелю 6A/6A и гомозиготного генотипа 5A/5A по редкому аллелю получено как 32,6 и 14,0% (см. табл. 1). Таким образом, в группе пациентов с ДКМП по сравнению с группой здоровых лиц отмечается статистически значимое преобладание аллеля 6А и генотипа 6А6А. Аллель 6А (65,8% против 59,3%, p=0,044) и генотип 6А/6А (42,1% против 32,6%, p=0,099) у пациентов с ДКМП встречались статистически значимо чаще, чем в группе контроля.

Важным моментом научного исследования является и выявление полового диморфизма в исследуемых группах, что представлено в дальнейших результатах. Процентные соотношения анализа полиморфизма 5A/6A гена MMP-3 -1171 среди больных с ДКМП мужчин указаны в табл. 2.

Таблица 2. Процентные соотношения анализа полиморфизма 5A/6A гена ММР-3 -1171 среди больных с ДКМП мужчин в сравнении с группой здоровых мужчин
Полиморфный аллельный вариант	ДКМП, мужчины (n=199)		Контроль, мужчины (n=199)
	абс.	%	абс.	%
6A/6A	83	41,7	65	32,7
5A/6A	95	47,7	106	53,3
5A/5A	21	10,6	28	14,1
Итого	199	100,0	199	100,0
Аллели	абс.	%	абс.	%
Аллель 6A	261	65,6	236	59,3
Аллель 5A	137	34,4	162	40,7
Итого	398	100,0	398	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	1,307 [0, 980–1, 743]
6A/6A	83	41,7	65	32,7
5A/6A +5A/5A	116	58,3	134	67,3
Итого	199	100,0	199	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	1,475 [0, 980–2, 220]

Процент распространенного гомозиготного генотипа 6A/6A среди больных мужчин с ДКМП согласно результатам исследования получен как 41,7%, частоты гетерозиготного генотипа 5A/6A и редкого гомозиготного генотипа 5A/5A определены как 47,7 и 10,6% соответственно. В контрольной группе мужского пола верифицирован наибольший процент мужчин с гетерозиготным генотипом 5A/6A – 53,3%. Частоты других генотипов в группе здоровых мужчин получены в меньшем проценте случаев: гомозиготный генотип по распространенному аллелю 6A/6A – 32,7%, гомозиготный генотип 5A/5A по редкому аллелю – 14,1%. Не получены статистически значимые различия ни по одному из генотипов при сравнении пациентов основной и контрольной групп (см. табл. 2).

Итоговые данные полиморфизма 5A/6A гена ММР-3 -1171 среди больных с ДКМП женщин и женщин контрольной группы демонстрирует табл. 3.

 

Таблица 3. Итоговые данные полиморфизма 5A/6A гена ММР-3 -1171 среди больных с ДКМП женщин и женщин контрольной группы
Полиморфный аллельный вариант	ДКМП, женщины (n=12)		Контроль, женщины (n=22)		р
	абс.	%	абс.	%
6A/6A	3	25,0	7	31,8	0,677
5A/6A	8	66,7	12	54,5	0,494
5A/5A	1	8,3	3	13,6	0,649
Итого	12	100,0	22	100,0	0,951
Аллели	абс.	%	абс.	%
Аллель 6A	14	58,3	26	59,1
Аллель 5A	10	41,7	18	40,9
Итого	24	100,0	44	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	0,969 [0, 353–2, 660]
6A/6A	3	25,0	7	31,8	0,677
5A/6A+5A/5A	9	75,0	15	68,2
Итого	12	100,0	22	100,0
ОШ; 95% ДИ ОШ	0,714 [0, 146–3, 485]

Соотношение генотипов в основной группе женского пола распределилось следующим образом: гетерозиготный генотип 5A/6A – 66,7%, распространенный гомозиготный генотип 6A/6A среди больных женщин с ДКМП – 25,0%, редкий гомозиготный генотип 5A/5A – 8,3%. В контрольной группе задокументировано максимальное количество лиц женского пола – носителей гетерозиготного генотипа 5A/6A – 54,5%. Число женщин контрольной группы с гомозиготным генотипом по распространенному аллелю 6A/6A – 31,8%, с гомозиготным генотипом 5A/5A по редкому аллелю – 13,6% (см. табл. 3).

Обсуждение и заключение

Согласно полученным нами данным аллель 6А (65,8% в группе больных с дилатацией миокарда различного генеза против 59,3% в группе здоровых лиц, p=0,044) и генотип 6А/6А (42,1% у пациентов основной группы по сравнению с 32,6%, p=0,039) у пациентов с ДКМП встречались достоверно чаще, чем в контрольной группе. Резюмируя результаты, получаем следующее: показана ассоциация аллеля 6А и генотипа 6А/6А полиморфного локуса -1171 5A/6A гена ММР-3 с ДКМП. Последовательность нуклеотидов в промоторе гена влияет на эффективность связывания регулирующих веществ. Носители разных аллелей отличаются уровнем экспрессии гена и, как следствие, уровнем белка в тканях-мишенях. У носителей аллеля 6A и генотипа 6A6A экспрессия в миокард снижается, активируется проколлагеназа 1-го типа. Это способствует отложению внеклеточного матрикса и ремоделированию сердечной мышцы. Результаты нашего исследования отличаются от результатов L. Tang и соавт. [18] в китайской популяции, которые доказали преобладание аллеля 5A гена ММР-3 у пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией. Понятно, что данная популяция отличается от европеоидов. Таким образом, в нашем исследовании показана ассоциация аллеля 6А и генотипа 6А/6А полиморфного локуса -1171 5A/6A гена ММР-3 с ДКМП.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare that there is not conflict of interests.

About the authors

Oxana O. Kuznetsova

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: nicoulina@mail.ru

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation

Svetlana Yu. Nikulina

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: nicoulina@mail.ru

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

Anna A. Chernova

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: anechkachernova@yandex.ru

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

Vladimir N. Maksimov

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University; 2Institute of Internal and Preventive Medicine – a branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics

Email: medik11@mail.ru

D. Sci. (Med.)

Russian Federation

References

Supplementary files