Interrelation of polymorphic allelic rs619203 option of a gene receptor of a tirozinkinaza (ROS1) with cardiovascular diseases at patients with an ischemic stroke

Full Text

Г ен ROS1 имеет позицию в хромосоме - 117,301,021 и функционально значимый поли- морфизм rs619203, Cys2229Ser. Полиморфизм rs619203 гена ROS1 изучен у пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) [1-3]. Независимое исследование 3657 лиц с острым ИМ на наличие полиморфизмов rs12510359 (PALLD), rs619203 (ROS1), rs1376251 (TAS2R50), rs1151640 (OR13G1) и rs4804611 (ZNF627) не выявило корреляции с данными однонуклеотид- ного полиморфизма (ОНП) [3]. Было изучено 11 053 Таблица 1. Половозрастная характеристика пациентов с ИИ Пол ИИ (n=124) n М± Минимальный-максимальный возраст больных Ме [Q25-Q75] Мужчины 75 57±11,51 25-79 57 [50; 64, 5] Женщины 49 60,46±11,04 33-76 63 [54; 70] Суммарно 96 58,41±11,39 25-79 60 [51; 66, 75] Здесь и в табл. 1-3.  - квадратичное отклонение, Q - перцентили, Ме - медиана. Таблица 2. Половозрастная характеристика лиц с ИИ в связи с ССЗ Сердечно-сосудистая патология Пол ИИ (n=124) n М± Минимальный-макси- мальный возраст больных Ме [Q25-Q75] ГБ (n=116) Мужчины 69 55,00±12,52 35-73 57 [48, 5; 67, 5] Женщины 47 58,07±10,22 35-72 58,5 [53, 5; 65, 5] Суммарно 116 56,72±11,15 35-73 58 [51, 0; 64, 5] Отсутствие ГБ (n=30) Мужчины 10 54,6±18,11 13-74 59,5 [42, 5; 67, 5] Женщины 20 61,7±11,48 44-86 62,5 [51; 70] Cуммарно 30 59,33±14,13 13-86 62,5 [49, 5; 70] ФП (n=9) Мужчины 5 62,75±10,31 52-73 63 [53; 72, 25] Женщины 4 66,0±4,36 63-71 64 [63; 71] Суммарно 9 64,14±7,90 52-73 64 [56; 71] Отсутствие ФП (n=115) Мужчины 73 56,57±11,57 25-79 57 [49, 5; 64] Женщины 42 60,0±11,33 33-76 63 [52, 5; 69, 25] Суммарно 115 57,96±11,53 25-79 59 [51; 56] ИБС (n=20) Мужчины 9 66,33±7,28 56-79 65 [60, 5; 72, 5] Женщины 11 67,57±8,48 51-76 71 [63; 74] Суммарно 20 66,88±7,58 51-79 67 [62, 25; 72, 75] Отсутствие ИБС (n=104) Мужчины 58 55,25±11,02 25-73 55 [48, 25; 63] Женщины 46 58,91±11,36 33-76 63 [52, 5; 65, 75] Суммарно 104 56,71±11,30 25-76 57 [50; 64] СН (n=17) Мужчины 7 60,40±3,65 56-64 62 [56, 5; 63, 5] Женщины 10 65,38±8,67 51-74 69 [56, 25; 71, 75] Суммарно 17 63,46±7,39 51-74 63 [56, 5; 71] Отсутствие СН (n=106) Мужчины 71 56,39±11,92 25-79 57 [49; 65] Женщины 35 59,19±11,34 33-76 63 [52; 66] Суммарно 106 57,45±11,71 25-79 58,5 [50; 62, 25] СД (n=17) Мужчины 8 58,38±11,21 43-73 56,50 [48, 75; 70, 75] Женщины 9 65,50±9,59 51-76 65 [56, 25; 75, 50] Суммарно 17 61,94±10,73 43-76 63,5 [51, 75; 72, 75] Отсутствие СД (n=105) Мужчины 69 56,78±11,66 25-79 58 [50; 64] Женщины 36 58,67±10,99 33-74 63 [51, 75; 66, 25] Суммарно 105 57,49±11,38 25-79 59 [51; 65] ОНП в 6891 гене и установлено, что носительство rs619203 повышает риск возникновения ИМ в 1,15 раза для гетерозигот (CG) и в 1,75 раза - для го- мозигот (TT) [4]. Изучена взаимосвязь между ОНП, имеющими взаимосвязь с ишемической болезнью сердца (ИБС): гена rs1151640OR13G1, гена rs11881940HNRPUL1, гена rs3746731 CD93, генов rs10757274CDKN2A и CDKN2B у 2145 лиц с семейной гиперхолестеринемией на модели пропорциональ- ных рисков Кокса. В то же время не найдено ассоциа- ции полиморфизма rs529038 (Asp2213Asn) гена ROS1 с ИБС в греческой популяции [5]. Цель исследования: изучение роли полиморфного аллельного варианта rs619203 гена ROS1 в связи с сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) у паци- ентов с ишемическим инсультом (ИИ). Материал исследования Проведено обследование 124 лиц с ИИ. Участни- ки находились на лечении в неврологическом центре ФГБУЗ «Сибирский клинический центр» ФМБА России (Красноярск). Главным критерием включения в основную группу стал подтвержден- ный диагноз ИИ. Критерии отбора в основную группу: Наличие подтвержденного диагноза «острое нару- шение мозгового кровообращения». Место основного проживания - Красноярск. Способность больного выполнять необходимые процедуры. Подписание информированного согласия на ис- следование. Таблица 3. Половозрастная характеристика пациентов контрольной группы Группа Пол Контроль (n=475) n М± Минимальный-максимальный возраст больных Ме [Q25-Q75] Контрольная группа (n=475) Мужчины 320 57,01±7,03 41-69 56,37 [51, 51; 63, 51] Женщины 155 58,24±7,57 38-69 61,07 [50, 99; 64, 38] Суммарно 475 57,41±7,23 38-69 57,46 [51, 44; 63, 80] Таблица 4. Распределение частот генотипов и аллелей rs619203 гена ROS1 среди пациентов с инсультом на фоне ГБ и лиц контрольной группы Генотипы: Инсульт на фоне ГБ (n=116) Контроль (n=475) p n %±m n %±m GG 75 64,7±4,4 234 49,3±2,3 0,004 CG 34 29,3±4,2 203 42,7±2,3 0,011 CC 7 6,0±2,2 38 8,0±1,2 0,603 Аллели: Аллель G 184 79,3±2,7 671 70,6±1,5 0,010 Аллель C 48 20,7±2,7 279 29,4±1,5 0,010 ОШ; 95% ДИ 1,594; 1,127-2,255 Генотип GG 75 64,7±4,4 234 49,3±2,3 0,004 Генотипы CG+CC 41 35,3±4,4 241 50,7±2,3 0,004 ОШ; 95% ДИ 1,884; 1,237-2,870 Здесь и далее в табл. 4-8: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля. Таблица 5. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма rs619203 гена ROS1 среди больных с ИИ на фоне ФП и ее отсутствия Генотипы: ИИ без ФП (n=115) ИИ на ФП (n=9) p n %±m n %±m GG 72 62,6±4,5 5 55,6±16,6 0,950 CG 34 29,6±4,3 4 44,4±16,6 0,577 CC 9 7,8±2,5 0 0 0,828* Аллели: Аллель G 178 77,4±2,8 14 77,8±9,8 0,970 Аллель C 52 22,6±2,8 4 22,2±9,8 0,970* ОШ; 95% ДИ 0,978; 0,309-3,099 Генотип GG 72 62,6±4,5 5 55,6±16,6 0,950* Генотипы CG+CC 43 37,4±4,5 4 44,4±16,6 0,950* ОШ; 95% ДИ 0,747; 0,190-2,932 Здесь и далее в табл. 5-8: р*- уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера. Критерии исключения: Пациенты с неуточненным диагнозом «острое на- рушение мозгового кровообращения». Жители, проживающие вне Красноярска. Лица, не способные выполнять необходимые про- цедуры. Отказ от включения в исследование. Распределение участников с ИИ по полу и их средний возраст представлены в табл. 1. В группе лиц с ИИ были 124 человека, средний воз- раст - 58,41±11,39 года, из которых - 75 мужчин, средний возраст - 57±11,51 года, и 49 женщин, сред- ний возраст - 60,46±11,04 (см. табл. 1). В табл. 2 представлена половозрастная характери- стика пациентов с ИИ в зависимости от имеющихся ССЗ. Группа контроля представлена популяционной вы- боркой из 475 человек (155 женщин, 320 мужчин), жителей Новосибирска, обследованных в рамках программы Всемирной организации здравоохране- ния «MONICA». Средний возраст лиц группы контро- ля составил 57,41±7,23 года. Обследование контрольной группы включало: данные антропометрии (рост, масса тела), социально-демографические характери- стики, опрос о курении, потреблении алкоголя (ча- стота и типичная доза), уровне физической активно- сти, измерение артериального давления (АД), оценка липидного профиля (общий холестерин, триглице- риды, холестерин липопротеидов высокой плотно- сти), опрос на выявление стенокардии напряжения (Rose), электрокардиография покоя в 12 отведениях с оценкой по Миннесотскому коду. В табл. 3 представлена половозрастная характери- стика контрольной группы. Методы исследования Клиническое обследование включало оценку нев- рологических симптомов, исследование соматиче- ского статуса, контроль АД, запись электрокардио- граммы, рентгенографию органов грудной клетки, общий и биохимический анализы крови, компью- терную и/или магнитно-резонансную томографию головного мозга. Анализировались продолжитель- ность, тяжесть и последовательность развития сопут- Таблица 6. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма rs619203 гена ROS1 среди больных с ИИ на фоне ИБС Генотипы: ИИ без ИБС (n=104) ИИ на фоне ИБС (n=20) p n %±m n %±m GG 64 61,5±4,8 13 65,0±10,7 0,968 CG 32 30,8±4,5 6 30,0±10,2 0,844 CC 8 7,7±2,6 1 5,0±4,9 0,964* Аллели: Аллель G 160 76,9±2,9 32 80,0±6,3 0,826 Аллель C 48 23,1±2,9 8 20,0±6,3 0,826 ОШ; 95% ДИ 0,833; 0,360-1,929 Генотип GG 64 61,5±4,8 13 65,0±10,7 0,968 Генотипы CG+CC 40 38,5±4,8 7 35,0±10,7 0,968 ОШ; 95% ДИ 0,862; 0,317-2,342 ствующих соматических заболеваний и факторов риска. Изучался семейный анамнез, включавший оценку наличия нарушений мозгового кровообра- щения в анамнезе, состояние АД, наличие артериаль- ной гипертензии, заболеваний сердца (ИМ, наруше- ния ритма, сердечная недостаточность - СН), нали- чие факторов риска (курение, повышенный индекс массы тела, отягощенная наследственность, сахар- ный диабет - СД). Молекулярно-генетические методы исследования Данные генотипирования предоставлены ФГБУ НИИ терапии и профилактической медицины (Но- восибирск) и получены в рамках договора о сотруд- ничестве от 01.12.2008 г. В соответствии с Хельсин- ской декларацией для проведения исследования бы- ли получены разрешение Локального этического ко- митета при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно- Ясенецкого, а также информированное согласие на проведение молекулярно-генетического исследова- ния (Протокол №16 от 16.12.2014 г.). Молекулярно- генетическое исследование проводили в ФГБУ НИИТПМ (Новосибирск). Геномную ДНК выделяли из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с применением протеиназы К с последую- щей экстракцией фенол-хлороформом. К образцу крови (10 мл) добавляли 5-6 объемов буфера А (10 мМтрис-НСl, pH=7,5; 10 мМ NaCl; 3 мМ MgCl2), растирали сгустки в гомогенизаторе. Осадки, полученные центрифугированием при 2500 g, промыва- ли 2 раза буфером А и ресуспензировали в 0,5 мл бу- фера В (10 мМ этилендиаминтетраацетата; 100 мМNaCl; 50 мМтрис-НСl, pH=8,5). После добавле- ния SDS (буфера для выделения ДНК) до 0,5% и про- теиназы К до 200 мкг/мл смесь инкубировали в тече- ние ночи при 37°С. Депротеинизацию проводили последовательно водонасыщенным фенолом, сме- сью фенол-хлороформа (1:1) и, наконец, хлорофор- мом. Потом добавляли изопропиловый спирт, акку- ратно перемешивали до образования клубочка, затем охлаждали в морозильнике (-20°С) в течение 1 ч. Оса- док, полученный центрифугированием на микро- центрифуге«Eppendorf», в течение 10 мин промыва- ли 70% этанолом (2 раза), высушивали и растворяли в воде до концентрации ДНК 0,5 мкг/мкл [6, 7]. Методы статистического анализа данных Статистическую обработку данных проводили с применением пакета программ Statistica 7.0 [8]. Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета прикладных программ Excel, Statistica for Windows 6.0 и SPSS 13. Качественные критерии представлены в виде процентных долей со стандартной ошибкой доли. Для определения стати- стической значимости различий между качествен- ными признаками применяли критерий 2. Если ожи- даемые частоты были менее 5, то применяли точный критерий Фишера. Различия в распределении частот аллелей и генотипов изучаемых генов между группа- ми оценивали посредством критерия 2. Если объем выборки не превышал 5 случаев, применяли крите- рий Фишера [9, 10]. Относительный риск заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как отношение шан- сов (ОШ). Для оценки ассоциации между определен- ными генотипами и риском развития заболевания оценивали ОШ по стандартной формуле ОШ=(ad)/(bc), где a - частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b - частота аллеля (генотипа) в контрольной группе, c - сумма частот остальных ал- лелей (генотипов) в выборке, d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной вы- борке. OШ указано с 95% доверительным интервалом (ДИ). Критический уровень значимости (p) при про- верке статистических гипотез в данном исследова- нии принимали равным 0,05 [11, 12]. Результаты С целью изучения роли полиморфного аллельного варианта rs619203 гена ROS1 в развитии инсультов прогенотипированы 124 пациента с ИИ и 475 чело- век из контрольной группы. Нами проведено выделение в отдельную подгруппу лиц с ИИ на фоне гипертонической болезни (ГБ). Так, частота гомозиготного генотипа AA по распро- страненному аллелю у больных с ИИ на фоне ГБ со- ставила 64,7%±4,4; гетерозиготного генотипа CG - 29,3%±4,2 и гомозиготного генотипа CC по редкому аллелю - 6,0%±2,2. В контрольной группе 49,3%±2,3 были носителями гомозиготного генотипа GG по распространенному аллелю; 42,7%±2,3 - гетерози- готного генотипа CG и 8,0%±1,2 - гомозиготного ге- нотипа CC по редкому аллелю. По результатам исследования установлено, что частота носителей гомозиготного генотипа GG по распространенному аллелю среди пациентов c ИИ на фоне ГБ (64,7%±4,4) была статистически значи- мо выше по сравнению с контрольной группой (49,3%±2,3); р=0,004. Также наблюдается статисти- чески значимое преобладание гетерозиготного ге- нотипа CG в группе контроля (42,7%±2,3) в сравне- нии с лицами с ИИ на фоне ГБ (29,3%±4,2; p=0,011); табл. 4. Таблица 7. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма rs619203 гена ROS1 среди пациентов с ИИ на фоне СН Генотипы: ИИ без СН (n=106) ИИ на фоне СН (n=17) p n %±m n %±m GG 68 64,2±4,7 8 47,1±12,1 0,281 CG 30 28,3±4,4 8 47,1±12,1 0,204 CC 8 7,5±2,6 1 5,9±5,7 0,797* Аллели: Аллель G 166 87,3±2,7 24 70,6±7,8 0,438 Аллель C 46 21,7±2,7 10 29,4±7,8 0,438 ОШ; 95% ДИ 0,665; 0,297-1,490 Генотип GG 68 64,2±4,7 8 47,1±12,1 0,281 Генотипы CG+CC 38 35,8±4,7 9 52,9±12,1 0,281 ОШ; 95% ДИ 0,497; 0,177-1,394 Таблица 8. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма rs619203 гена ROS1 среди лиц с инсультом на фоне СД Генотипы: ИИ без СД (n=106) ИИ на фоне СД (n=17) p n %±m n %±m GG 67 63,2±4,7 9 52,9±12,1 0,589 CG 33 31,1±4,5 5 29,4±11,1 0,888 CC 6 5,7±2,3 3 17,6±9,2 0,208* Аллели: Аллель G 167 78,8±2,8 23 67,6±8,0 0,224 Аллель C 45 21,2±2,8 11 32,4±8,0 0,244 ОШ; 95% ДИ ОШ 0,563; 0,256-1,242 Генотип GG 67 63,2±4,7 9 52,9±12,1 0,589 Генотипы CG+CC 39 36,8±4,7 8 47,1±12,1 0,589 ОШ; 95% ДИ 0,655; 0,234-1,836 Разделение больных, перенесших ИИ, по отсут- ствию и имеющейся фибрилляции предсердий (ФП) позволило обнаружить следующие отличия. Так, ча- стота гомозиготного генотипа GG по распростра- ненному аллелю у лиц с ИИ без ФП составила 62,6%±4,5; гетерозиготного генотипа CG - 29,6%±4,3 и гомозиготного генотипа CC по редкому аллелю - 7,8%±2,5. В группе участников с ИИ и ФП 55,6%±16,6 были носителями гомозиготного генотипа GG по распространенному аллелю; 44,4%±16,6 - носителя- ми гетерозиготного генотипа CG и ни одного обсле- дуемого - носителя гомозиготного генотипа CC по редкому аллелю. По результатам исследования уста- новлено, что статистически значимого преоблада- ния ни одного из генотипов в обследуемых группах нет (табл. 5). При выделении в отдельную группу пациентов с инсультом на фоне ИБС распределение генотипов по сравнению с больными без ИБС было статистически неразличимо. Так, в группе лиц с ИИ без ИБС генотип GG имели 61,5%±4,8; гетерозиготный генотип CG - 30,8%±4,5 и генотип CC - 7,7%±2,6, в группе пациен- тов с инсультом на фоне ИБС генотип GG имели 65,0%±10,7; гетерозиготный генотип CG - 30,0%±10,2 и генотип CC - 5,0%±4,9 (табл. 6). Распределение генотипов у пациентов с ИИ на фо- не СН по сравнению с больными без СН не обнару- жило статистически значимых различий. Так, в груп- пе лиц с ИИ с отсутствием СН генотип GG имели 64,2%±4,7; гетерозиготный генотип CG - 28,3%±4,4 и генотип CC - 7,5%±2,6. В группе больных с инсультом на фоне СН генотип GG имели 47,1%±12,1; гетерози- готный генотип CG - 47,1%±12,1 и генотип CC - ни один обследуемый (табл. 7). Нами проведено выделение в отдельную подгруппу пациентов с ИИ на фоне СД. Так, частота гомозигот- ного генотипа GG по распространенному аллелю у лиц с ИИ с отсутствием СД составила 63,2%±4,7; гете- розиготного генотипа CG - 31,1%±4,5 и гомозигот- ного генотипа CC по редкому аллелю - 5,7%±2,3. В группе больных с ИИ на фоне СД 52,9%±12,1 были носителями гомозиготного генотипа GG по распро- страненному аллелю; 29,4%±11,1 - носителями гете- розиготного генотипа CG и 17,6%±9,2 - носителями гомозиготного генотипа CC по редкому аллелю. По результатам исследования установлено, что ча- стота носителей гомозиготного генотипа CC по ред- кому аллелю среди больных c ИИ на фоне СД (17,6%±9,2) была статистически незначимо выше по сравнению с пациентами с инсультом без СД (5,7%±2,3; p=0,208); табл. 8. Частота носителей аллеля G среди пациентов с ИИ без отягощенной наследственности составила 78,9%±2,6, у лиц с отягощенной наследственностью - 68,8%±11,8. Частоты носителей аллеля C распределились следую- щим образом: пациенты с ИИ без отягощенной наслед- ственности - 21,1%±2,8 и с отягощенной наследствен- ностью - 31,3%±11,8. Не установлено статистической значимости по аллелям данного гена (см. табл. 8). Обсуждение Согласно результатам исследования установлено, что частота носителей гомозиготного генотипа GG по распространенному аллелю среди пациентов с ИИ, имеющих ГБ, была статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой. Таким образом, генотип GG обладает условно протективным эффек- том в отношении развития ИИ у лиц с ГБ, ОШ обнаружить носителя генотипа GG в группе с инсультом со- ставляет 1,59 по сравнению с носителями двух других генотипов. Это несколько противоречит данным зару- бежных ученых. В исследовании, проведенном япон- скими учеными, участвовали 1362 пациента с инсуль- том (822 - с тромбоэмболическим инсультом, 333 - с внутричерепным кровоизлиянием и 207 - с субарах- ноидальным кровотечением) и 2070 человек группы контроля. Было проанализировано 50 полиморфиз- мов в 38 кандидатных генах методами полимеразной цепной реакции и секвенирования. Установлено, что полиморфизм rs619203 (GC (Cys2229Ser) гена ROS1 ассоциирован с тромбоэмболическим инсультом [13]. Полученные нами данные могут быть обусловлены некоторыми генетическими особенностями сибир- ской популяции, зависящими от климатических усло- вий, географии проживания, и подтверждают мульти- факторный характер развития ИИ на фоне ГБ. При оценке частот распространенности генотипов гена ROS1 во взаимосвязи с другой сердечно-сосудистой патологией статистически значимых различий не по- лучено. Однако имеющиеся ССЗ являются отягчаю- щим фактором при развитии ИИ, и ввиду отсутствия данных по ОНП гена ROS1 в других популяциях этот вопрос требует дальнейшего изучения. Заключение Таким образом, результаты проведенного исследо- вания показывают, что в группе пациентов с ИИ с ГБ имеются статистически значимое преобладание го- мозиготного генотипа GG по распространенному аллелю гена ROS1 и тенденция к снижению числа но- сителей гетерозиготного генотипа CG в группе лиц с ИИ и ГБ. Полученные данные подтверждают мульти- факторный характер ИИ, ассоциированного с ГБ, и свидетельствуют о том, что носительство генотипа GG гена ROS1 обладает условно протективным эф- фектом в отношении развития ИИ у пациентов с ГБ.

About the authors

D. A Nikulin

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nikulin86@list.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

V. A Shulman

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ShulmanЗ6@mail.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

S. V Prokopenko

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: Psv@mail.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

S. Yu Nikulina

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

A. A Chernova

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: anechkachernova@yandex.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

I. M Platunova

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: platunova_irina@mail.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

V. N Chernov

Prof. V.F.Voino-Yasenetski Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: сhernovortstom@mail.ru
660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, ul. Partizana Zhelezniaka, d. 1

References

Supplementary files